Die Labordiagnose der Herpes …

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Abstrakt

Herpes-simplex-Virus (HSV) Typ 1 und 2 Ursache Genital-Herpes-Infektionen und sind die häufigste Ursache von Genitalgeschwüren Krankheit in den Industrienationen. Obwohl diese Infektionen sehr häufig sind, bleiben die meisten von ihnen zu selten diagnostiziert, weil sie asymptomatisch oder unerkannt sind. Eine klinische Diagnose von Herpes genitalis sollte immer durch Labortests bestätigt werden; Dies kann für die Virusisolierung durch den Einsatz von direkten Tests durchgeführt werden, der Nachweis von Antigen oder, in jüngerer Zeit, der Nachweis von HSV DNA molekulardiagnostischen Techniken. Tests für die Serotypen ist wegen der unterschiedlichen prognostische und Beratung Implikationen empfohlen. Typenspezifische HSV-Serologie wird immer leichter verfügbar und wird die Fähigkeit zu verbessern, um die Diagnose zu stellen und die klinische Behandlung in ausgewählten Patienten führen.

Schlüsselwörter: Diagnose, Genital-Herpes, Genitalgeschwüren Krankheit, Herpes-simplex-Virus, STI

Genital-Herpes-simplex-Virus (HSV) Infektion ist sehr häufig in der ganzen Welt, mit epidemiologischen Untersuchungen steigenden Infektionsraten in den meisten Ländern demonstrieren (1, 2). HSV ist die häufigste Ursache von Genitalgeschwüren Krankheit in den Industrieländern und Infektionen 1 oder 2 HSV-Typen zurückzuführen sein kann (2). Obwohl die Mehrheit der Herpes genitalis HSV-2 zurückzuführen ist, wird ein zunehmender Anteil als aufgrund HSV-1 (2) anerkannt. Obwohl die klinische Verlauf der akuten ersten Folge Herpes genitalis bei Patienten mit HSV-1 und HSV-2-Infektionen ähnlich ist, ist die Häufigkeit und Schwere von Rezidiven weniger mit HSV-1 als mit HSV-2 (3). Darüber hinaus sind die Schwere der klinisch manifesten ersten Episoden und Reaktivierung mit HSV-2-Infektion niedriger in Patienten mit vor HSV-1 (2). Trotz des verstärkten Bewusstsein für diese Infektionen, bleiben sie selten diagnostiziert, weil die Mehrzahl der Infektionen asymptomatisch oder unerkannt sind (4). Symptomatische Infektionen können bei ungewöhnlichen oder atypische Weise präsentieren, die diagnostische Herausforderung zu erhöhen (5). Die meisten Übertragung an Partner oder weniger häufig auf das Neugeborene, auftritt, während die infizierten Person asymptomatisch (6, 7). Infektion mit HSV ist auch das Risiko des Erwerbs oder der Übertragung von HIV-Infektion zu erhöhen, (8) gezeigt. Antivirale Therapie reduziert subklinische Abbau von HSV, so deutlich zu reduzieren Übertragung (9). Da die beteiligten komplexen Probleme bei der Verwaltung von Genital HSV-Infektion, die Herausforderung für den Kliniker ist, um zu bestimmen, wann und wie für den Genital Herpes-Infektion zu testen.

Es wurden für HSV-Infektionen in Diagnosetechniken in letzter Zeit viele Fortschritte, einschließlich der neuen Virusnachweisverfahren und serologischen Tests. Die klinische Diagnose von Herpes genitalis sollte immer durch Labortests bestätigt werden, einschließlich Serotypisierung, weil die Serotyp beeinflusst sowohl die Prognose und Beratung. Die definitive Diagnose von Herpes genitalis beruht im Genitalbereich, entweder durch Virusisolierung oder den Nachweis von Antigen die Anwesenheit von HSV zu demonstrieren. In einigen Laboratorien, ersetzt der Nachweis von HSV-DNA molekulardiagnostischen Techniken unter Verwendung von Viruskultur und Antigennachweis. Serologische Tests ist manchmal nützlich, bei symptomatischen Patienten, wenn eine direkte Methoden negative Ergebnisse erbracht haben oder bei asymptomatischen Patienten vergangenen oder gegenwärtigen Infektion zu bestimmen. Der Wert von Labortests zur Diagnose der HSV-Infektion wird von der Art des Tests ab, die Qualität der Probe erhalten wurde, die Fähigkeit des Labors den Test genau durchzuführen, und die Interpretation der Testergebnisse von dem anfordernden Kliniker.

Specimen Auswahl, Sammlung und Transport

Direkte Methoden

Proben von Bläschen innerhalb der ersten drei Tage nach ihrem Erscheinen erhalten werden, sind die Proben der Wahl, aber auch andere Läsion Material aus älteren Läsionen oder Tupfer von Genitalsekreten sollte erhalten werden, wenn Verdacht auf eine HSV-Infektion hoch ist (10, 11). Sobald Verkrustung und Heilung begonnen haben, fällt die Wiederfindungsrate von HSV scharf. Die Verwendung von Alkohol oder Iodophore die Läsionen zu reinigen, kann das Virus zu inaktivieren und sollten daher vermieden werden. Calciumalginat Tupfer sind toxisch für HSV und deshalb nicht verwendet werden sollte (12).

Das Vesikel sollte mit einer sterilen Nadel oder Skalpell und einem sterilen Dacron oder Rayon Tupfer mit einem Kunststoffschaft unroofed werden sollte fest in die Basis der Läsion gedreht werden Epithelzellen zu ermöglichen, auf dem Tupfer gesammelt werden. Idealerweise sollte mehr als eine Läsion zu beproben. In ähnlicher Weise für ulcerative Läsionen sollte ein Tupfer fest in der Basis von einem oder mehreren Läsionen gedreht werden. Der Tupfer (s) sollten sofort in virale Transportmedium wie M5 Transportmedium eingesetzt werden. Die Welle der Tupfer sollte gebrochen werden, bevor die Kappe ersetzt wird, so dass die Welle nicht mit Schließung stören und Leckage verhindert wird. Die Probe sollte bei 4 gehalten werden&# X000b0; C und für die Weiterverarbeitung innerhalb von 48 h in das Labor transportiert. Während des Transports sollte die Probe, indem ein Cold-Pack oder Eiswürfel in einem verschließbaren Plastikbeutel in der Verpackung vor Hitze geschützt werden. Virus Probenentnahmetupfer mit passenden Transportröhren sind im Handel erhältlich.

Eine Cytospin Vorbereitung des ursprünglichen viralen Transportmedium ist der beste Weg, eine Folie für direkte Fluoreszenztest (DFA) aufgrund der Qualität der resultierenden Folien herzustellen. Am Krankenbett, durch den Kliniker Folien können wie oben durch Rollen des Tupfers gesammelt hergestellt werden, fest über eine oder mehrere diskrete Bereiche auf einem Objektträger. Alternativ kann die Basis der Läsion mit einem Spatel oder einem ähnlichen Instrument abgeschabt werden, ohne dass die Läsion zu bluten, und das Material sollte auf einem Glasobjektträger über einen oder mehrere 5 mm bis 10 mm Durchmesser Bereichen angewendet werden. Der Glasobjektträger sollte dann an der Luft getrocknet werden. Wenn ein Objektträger für DFA gemacht wird, können mehrere Abstriche zum Anfärben mit spezifischen HSV-1 und HSV-2-Antiseren zu ermöglichen, hergestellt werden. Teflon-beschichtete Objektträger mit umschriebenen Brunnen sind im Handel für diese Anwendung zur Verfügung.

Der Tzanck Test wird nur noch selten zur Diagnose verwendet. Jedoch Material für dieses Verfahren kann durch Abkratzen der Basis der Läsion mit dem Rand einer Skalpellklinge gesammelt werden; das Material auf der Klinge wird dann auf einen Objektträger berührt und an der Luft getrocknet (13). Alternativ kann Material fest gesammelt werden, indem die Basis der Läsion mit einem Baumwoll- oder Dacron Tupfer Abtupfen. Ein Abstrich wird dann durch Walzen des Tupfer auf einem Objektträger vorbereitet.

Elektronenmikroskopie auf Läsion Flüssigkeit kann in einigen Fällen zu positiven Ergebnissen führen. Dieses Verfahren, obwohl eine schnelle, relativ unempfindlich und liefert in der Regel positive Ergebnisse nur an äußeren Läsionen, wie sie auf das Gesäß oder Oberschenkel auftreten. Die Positivitätsrate auf Schleimhäuten niedriger ist. Fluid gesammelt wird, vorzugsweise von einer ununterbrochenen Vesikel, ein Tuberkulin oder ähnliche Spritze und Nadel mit nur genügend Saugwirkung des Fluids in die Nadel zu bringen, aber nicht in die Spritze. Der Flüssigkeitstropfen auf einen Objektträger gegeben und an Luft trocknen gelassen. Alternativ wird das Vesikel aufgebrochen und ein Mikroskop-Objektträger wird auf den freiliegenden Tropfen Flüssigkeit berührt. Der Objektträger wird an der Luft trocknen gelassen und wird dann in der üblichen Weise in das Labor transportiert. Wenn das Labor in der Nähe befindet und die Probe dort sofort transportiert wird, kann die Spritze mit einem Zellkulturröhrchen zur Beimpfung durch Ziehen der Zellkulturflüssigkeit nach oben in die Nadel und Austreiben es zurück in das Rohr (13) verwendet werden.

Molekulare Ansätze für die HSV-Erkennung und Typisierung wurden in einigen Labors umgesetzt. Im allgemeinen für die Isolierung oder Antigennachweis entnommenen Proben sind auch für DNA Nachweisverfahren geeignet sind. Die erhöhte Empfindlichkeit von Methoden, die auf Nukleinsäure-Amplifikation über andere direkte Methoden (Kultur oder Antigennachweis) wird sichergestellt, dass auch Proben Läsion minimal Zellen enthalten, können mit guter Empfindlichkeit analysiert werden.

Indirekte serologische Methoden

Etwa 8 ml bis 10 ml Blut wird in der Regel in Röhrchen ohne Antikoagulans oder Konservierungsmittel gesammelt. Nachdem das Blut bei Raumtemperatur geronnen ist, wird das Serum durch Zentrifugation getrennt und auf ein anderes Glasfläschchen entfernt. Wenn es notwendig ist, das Serum zu speichern, kann es bei 4 gekühlt werden&# X000b0; C für mehrere Wochen oder gefroren bei oder unter -20&# X000b0; C. Vollblut sollte nicht eingefroren werden, weil die Zellen hämolysiert, die Probe nicht geeignet für die serologische Untersuchung zu machen. In der Regel wird ein einziges Exemplar bevorzugt, aber akuten und rekonvaleszenten Seren gesammelt sechs bis acht Wochen auseinander liegen in ausgewählten Situationen bevorzugt sein kann (14).

Diagnosetest

Direkte Methoden

Direkte Tests versuchen, die Anwesenheit von HSV in einer verdächtigen Läsion oder in Genitalsekreten zu demonstrieren. Idealerweise sollte die Probe von einer bläschenförmigen Läsion entnommen werden, die weniger als 24 Stunden anwesend war, denn wenn die Läsion zu Kruste begonnen hat, sinken die Testempfindlichkeit. Wenn mehrere Bläschen vorhanden sind, mehr als eine Läsion sollte probiert werden. Darüber hinaus ist die Testsensitivität niedriger bei Patienten mit rezidivierenden Läsionen als in denen mit ersten Episoden (15).

Viral Isolation

Standard-Viruskultur:

Rohr Kultur Isolation ist die traditionelle Goldstandard für die HSV-Erkennung und der Referenzmethode, an dem alle anderen Tests gemessen werden (16, 17). Während der Test 100% Spezifität für HSV-1 oder HSV-2 hat, hängt die Empfindlichkeit auf der Bühne der Läsion zum Zeitpunkt der Probenentnahme. Die Empfindlichkeit auch variiert von 75% für die ersten Folgen zu 50% für Rezidive (18, 19).

Sobald im Labor erhalten, sollte die Probe gevortext werden. Der Tupfer sollten dann von dem Transportmedium entfernt werden und fest gerollten gegen die Innenseite des Rohres so viel Flüssigkeit wie möglich zu exprimieren.

Einige Laboratorien kann ein Antibiotikum Vorbereitung auf die primären Proben vor der Inokulation in Zellkultur hinzuzufügen. Die Probe kann in das Kulturmedium inokuliert werden oder zuerst auf die Zellmonoschicht nach der Entfernung des Mediums (11) adsorbiert werden kann. Adsorption erleichtert den direkten Kontakt von Viruspartikeln mit den Zellen und verbessert die Infektiosität und erhöht sowohl die Anzahl der Isolate, und die Geschwindigkeit, mit der sie gewonnen werden. Nach der Adsorption des Inokulums auf der Monoschicht für 30 min bis 60 min bei 37&# X000b0; C wird das Medium ersetzt und die Inkubation fortgesetzt wird. Eventuell verbleibende Probe sollte bei 4 gekühlt werden&# X000b0; C oder bei -70 eingefroren&# X000b0; C bei der Impfung muss aufgrund der Toxizität wiederholt werden, bakterielle Kontamination oder aus anderen Gründen.

HSV wächst leicht in einer Vielzahl von Zelllinien, einschließlich der menschlichen Vorhaut-Fibroblasten, MRC-5, A549, Rhabdomyosarkom, Nerzlungenzellen, primären Kaninchennieren, CV-1, Vero und HEp-2-Zellen. Die ersten beiden werden verwendet, am häufigsten wegen ihrer erhöhten Empfindlichkeit im Vergleich zu den anderen Zelllinien (20, 21). Obwohl HSV Isolationszeiten auf dem Zustand und der Empfindlichkeit der Zelllinien für die Isolierung und der Menge des infektiösen Virus derzeit verwendeten variieren, werden die meisten Isolate nach zwei bis drei Tagen Kultivierung sichtbare cytopathische Wirkung (CPE) zeigen. Die Zellkultur-Monolayern sollten auf Anzeichen von CPE täglich untersucht werden. Die Kulturen sollten für sieben bis 10 Tage gehalten werden, abhängig von der Zelllinie verwendet. Vorläufige Identifizierung von HSV kann basierend auf der Entwicklung der charakteristischen CPE erfolgen. Die CPE aufgrund HSV entwickelt sich typischerweise als vergrößerte refractile, abgerundete Zellen (11). Das CPE beginnt fokal sondern breitet sich schnell aus anderen Teilen der Monoschicht zu beeinflussen. Gelegentlich kann mehrkernige Riesenzellen vorhanden sein. Einige Labors gehören ein DFA Verfahren unter Verwendung monoklonaler Antikörper in ihrem Virusisolierung Algorithmus zu bestätigen und das Isolat in einem einzigen Schritt eingeben.

Shell Fläschchen oder Zentrifugation verstärkte Kultur:

Viele Laboratorien jetzt Zentrifugation verstärkte (Shell-Fläschchen) Kulturmethoden verwenden, um Virusisolierung Zeiten (17) zu reduzieren. Die gleichen Proben für die traditionelle Virenkultur verwendeten Methoden können auch für Shell-Fläschchen Kulturen verwendet werden. Shell Vial Kultur kann auf eine Dauer von 16 h bis 48 h viral Isolationszeiten von eins bis sieben Tage zu reduzieren. Obwohl diese Verfahren schnell und spezifisch sind, sind sie etwas weniger empfindlich als herkömmliche Röhrchenkulturen und teurer sind (22).

Obwohl eine Reihe von Zelllinien verwendet werden können, sind MRC-5-Zellen am häufigsten verwendet. Wegen der verringerten Empfindlichkeit des Mantelfläschchen Verfahren, wurde vorgeschlagen, dass ein zusätzlicher Standardröhrchenkultur sollte für jede Probe in parallel beimpft werden. Die Färbung der Deck mit typspezifischen HSV-Antikörper verwendet HSV in Shell Vials zu identifizieren.

Genetisch Zelllinien entwickelt, die auch im Handel erhältlich, ermöglichen die Früherkennung von HSV-1 und HSV-2 die Enzyme Linked Virus induzierbaren System (ELVIS, Diagnostic Hybrids, Inc, USA). Die Replikation von HSV in diesen Zellen induziert -Galactosidaseproduktion und infizierte Zellen blau gefärbt, wenn sie mit einem geeigneten Substrat überlagert. Tippen kann dann durchgeführt werden, unter Verwendung von typspezifischen Antiseren auf beliebigen Mono blauen Zellen zeigt.

Typisierung von HSV-Isolaten:

Wie zuvor diskutiert, kann der Serotyp des HSV verantwortlich für Infektion prognostische Bedeutung. Deshalb, wenn der Eingabe nicht routinemäßig durchgeführt wird, sollte das Isolat gespeichert werden, bis bestimmt ist, ob Eingabe erforderlich ist oder nicht.

Sobald CPE Formen sollten die Kulturen mit HSV-Typ-spezifischen monoklonalen Antikörper-Reagenzien (zB kommerzielle Produkte von Trinity Biotech, Irland, oder Chemicon International, USA) gefärbt werden, bevor ein positives Ergebnis berichten (23). Die Meldung von typspezifischen HSV wird der Kliniker bei der Beratung und Behandlung des Patienten unterstützen.

antigen~~POS=TRUNC

Virale Antigennachweis kann eine geeignete Alternative zur Kultur sein für kleinere Laboratorien, in denen die Kosten Zelllinien aufrechtzuerhalten ist unberechtigt. Antigennachweis ist auch eine Alternative, wo Probenhandhabung und Transportbedingungen vorhandenes Virus inaktivieren könnten. Dies könnte auftreten, beispielsweise in Labors entfernten Standorten mit einer längeren Probentransportzeiten unter unsicheren Bedingungen zu dienen. Zum Nachweis von HSV in Läsionen kann die Empfindlichkeit der Antigen-Nachweistests der gleiche wie oder größer als die der Kultur (24, 25).

Der Nachweis von HSV-Antigene wurde in fixierten Zellen durch DFA-Tests oder Immunperoxidase-Tests an festen, solubilisierten Zellproben (24 -26) erreicht. Diese Verfahren können ein brauchbares Ergebnis auch in Abwesenheit von kultivierbaren Virus geben.

Antigennachweis durch DFA:

Der Nachweis der Anwesenheit von HSV-Antigens durch DFA-Färbung von Ausstrichen kann eine schnelle Zusatz zu der Zellkultur bereitzustellen. Es ist wesentlich, daß ein hochwertiges Muster für diesen Test erhalten wird; in dieser Einstellung kann die Testsensitivität als 90% so hoch sein, vor allem in der anfänglichen Infektionen (17).

Obwohl der Schlitten durch den Kliniker hergestellt werden können, ist es ideal durch das Labor mit einer Cytospin-Methode und ein Abstrichproben, wie zuvor beschrieben, gesammelt worden ist. Färbung der Objektträger wird wie vom Hersteller des Fluorescein-markierten Antikörper gerichtet ist. Der Objektträger wird mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, mit einem positiven Test durch die Anwesenheit eines charakteristischen Musters von Apfel grüne Fluoreszenz im Kern und Cytoplasma der basalen und Parabasalzellen angegeben. Es sollten nur intakte Zellen untersucht werden. Ein eindeutiges Ergebnis kann erzielt werden, wenn weniger als 50 intakten Zellen auf jeder Vertiefung vorhanden sind.

Tzanck Abstrichen

HSV-Infektion verursacht typischen zytopathischen Veränderungen in Genital Epithelzellen (3). Die Zellen werden vergrößert, mit intranukleären Einschlüssen, die oft mit der Bildung von mehrkernigen Zellen. Präparate sind mit einem Wright-Giemsa gefärbt und dann unter dem Lichtmikroskop untersucht. Hematoxylin und Eosin oder Papanicolaou Flecken können ebenfalls verwendet werden. Jedoch hat dieses Verfahren eine geringe Empfindlichkeit und unterscheidet nicht zwischen HSV-1 und HSV-2, noch zwischen HSV und zoster-Virus-Infektion Varicella. Dieser Test kann durchgeführt werden, wenn ein dringender Ergebnis benötigt wird und keine Alternative Test ist ab sofort verfügbar, aber es nicht die Notwendigkeit für Follow-up-Prüfung aller Negative mit einem empfindlicheren Test negieren.

Elektronenmikroskopie

Direkte Untersuchung der Vesikel Flüssigkeit oder anderen klinischen Material durch Elektronenmikroskopie für die Diagnose von HSV ist durch die Tatsache begrenzt, dass virale Morphologie nicht HSV zu unterscheiden von anderen Herpesviren verwendet werden (beispielsweise Varizella-Zoster-Virus) (13). Diese traditionelle Methode wurde von DFA-Färbung von Abstrichen weitgehend ersetzt, die typspezifische Differenzierung von HSV-1 und HSV-2 zur Verfügung stellen kann.

Virus DNA-Nachweis

Virale DNA können durch Hybridisierungstechniken unter Verwendung radioaktiv markierter oder biotinylierter Sonden (27, 28) detektiert werden. Diese Verfahren sind weitgehend durch empfindlichere und weniger mühsamen Prozeduren abgelöst worden, die Amplifikation der Ziel-HSV-DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwenden. Spezifität des Amplifikationsverfahrens wird entweder durch Unternehmen eine zweite PCR mit zielspezifischen Primern (nested PCR) oder durch HSV-spezifischen Sonde die Hybridisierung von amplifizierten Produkte gewährleistet. Die Mehrzahl von Laboratorien haben ihre Verwendung von Verfahren wie PCR zur Untersuchung der Verdacht HSV-Enzephalitis (29) beschränkt. In dieser Situation wird die erhöhte Empfindlichkeit gegenüber culture- oder Antigen-gestützten Verfahren gut erkannt, und der klinische Wert der positiven Ergebnissen ist eindeutig nachweisbar. Im Falle von möglichen Herpes genitalis, erkennt PCR viraler DNA für mehrere Tage nach Läsionen enthalten keine nachweisbaren infektiösen Viren (30). Dies kann bedeuten, dass ein Labor Schalt auf sensible Verfahren auf Basis von Nukleinsäure-Amplifikation eine erhöhte Anzahl von positiven Ergebnissen auf Läsion Proben mit möglichen klinischen Dilemmata in Bezug auf die Relevanz der positiven Ergebnisse nach der Behandlung erhalten haben. Obwohl PCR HSV-DNA aus späteren Stadien der Läsionen als Viruskultur erkennen kann, gibt es ein theoretisches Risiko von falsch-positiven Ergebnisse durch auftretende Kontamination vor der Verstärkung zu probieren. Laboratorien, die die PCR-basierte Verfahren müssen getrennte Bereiche und Anlagen für die Vor- und postamplification Handhabung von Proben zu haben, diese Art von Problem zu minimieren. Proben geben diskordanten Ergebnisse (beispielsweise positive und negative durch PCR auf die Kultur) werden in der Regel durch eine zweite PCR gerichtet auf ein anderes Gen, um sicherzustellen, Assay-Spezifität bestätigt.

Mit den jüngsten Fortschritten in der Automatisierung und Kit Entwicklungen für HSV-Erkennung und Typisierung von PCR (zB Real Art HSV1 / 2-Kit von Artus-Biotech USA), ist es wahrscheinlich, dass diese Methode wird besser für die Routinediagnosezwecke verwendet. Wie bei anderen molekulardiagnostischen Tests ist die Empfindlichkeit der PCR viel größer als der Goldstandard der Kultur (31 -38). Das Aufkommen der Echtzeit-PCR-Systeme, bei denen Produkte in einem geschlossenen Rohrsystem ohne Nachverstärkung Handhabung erkannt werden, hat sich das Risiko von falsch-positiven Ergebnisse durch PCR minimiert. PCR ist immer noch relativ teuer, die kleinen Reaktionsvolumina und minimale technische Hands-on-Zeit, während das Gerät in Echtzeit zu übernehmen (insbesondere, wenn Kit-basierte Reagenzien verwendet werden) machen diese Verfahren sehr kostengünstig für viele Labore.

Indirekte serologischen Tests

Der Nachweis von Antikörpern gegen HSV ermöglicht Diagnose, wenn andere virologische Methoden können keine negativen Ergebnissen durchgeführt oder Ertrag werden (39). Es ist besonders nützlich in der asymptomatischen Träger der Infektion identifiziert, da, wie oben diskutiert, die Mehrheit der Übertragung auftritt, während die Person asymptomatisch. Bisher hat sich die Verwendung dieser Tests weitgehend seroepidemiologische Studien und Fallmanagement für HSV beschränkt worden, während spezifische klinische Anwendungen für die serologische Untersuchung ein viel diskutiertes Thema bleibt. Tabelle &# X200B; Tabelle 1 1 beschreibt einige der aktuellen und vorgeschlagenen Anwendungen für serologische Tests für HSV. Tabelle &# X200B; Table2 2 zeigt die Interpretation von serologischen Tests für Herpes (2).

Verwendungsmöglichkeiten von Herpes simplex-Virus (HSV) Typ-spezifische Antikörper-Assays

Klinische, virologische und serologische Klassifizierung der Infektion mit Genital-Herpes-simplex-Virus (HSV)

Obwohl eine Reihe von Tests können HSV-Antikörper zu identifizieren, nur wenige verfügbare Tests sind in der Lage zwischen HSV-1 und HSV-2 (40) zu differenzieren. Serologische Tests, die nicht typspezifisch sind haben klinischen Nutzen begrenzt. Darüber hinaus ist kein serologischer Test zwischen oralen und genitale Infektion mit HSV zu differenzieren können. Obwohl es eine sehr enge serologische Beziehung zwischen HSV-1 und HSV-2, die jeweils eine sie kodieren, serologisch unterschiedlichen Glykoprotein G (gG-1 und gG-2). Dieser Unterschied wurde bei der Entwicklung von Typ-spezifische serologische Tests genutzt werden. Eine aktuelle Übersicht beschreibt die neuen HSV-Typ-spezifischen Antikörpertests (41). Schließlich scheint es, dass seroreversion oder Schwinden der Immunantwort auf gG-2 tritt mit der Zeit Bedenken bezüglich der langfristigen Zuverlässigkeit dieser Tests erhöhen (41).

westlicher Fleck

Western-Blot (WB) ist der Goldstandard für den Nachweis von Antikörpern gegen HSV (41). Diese Tests haben eine hohe Empfindlichkeit und die Fähigkeit, zwischen HSV-1 und HSV-2-Antikörpern zu unterscheiden. Seren reagierten gegen getrennte, feste Protein-Arrays ( «blots») entweder von HSV-1 oder HSV-2 infizierten Zelllysaten. Die Muster der Antikörperbindungsbänder sind sehr prädiktiv für die Infektion mit entweder HSV-1 oder HSV-2. Dieser Test ist teuer, zeitaufwendig und erfordert Fach Interpretation. Wenn die ersten Ergebnisse unbestimmt oder atypisch sind, die Adsorption von Seren mit typspezifischen Antigen und reblotting kann manchmal ‘aufzuräumen’ des Blots und Interpretation zu verbessern. Der WB für HSV ist derzeit nicht im Handel erhältlich.

Kommerzielle gG-basierte typspezifischen Tests

Obwohl die Leistung der typspezifischen Tests die meisten der verfügbaren Literatur Auswertung auf Kits von Gull Laboratories (USA) entwickelt beruhte, haben diese Tests nun aus dem Markt zurückgezogen.

Derzeit produzieren zwei Unternehmen vier Kits zur Diagnose von HSV-Typ-spezifischen Antikörpern. Fokus Technologies (USA), früher MRL Diagnostics, hat drei Tests: HSV-1 und HSV-2 enzyme-linked immunosorbent assays, und einen Immunoblot-Test sowohl für HSV-1 und HSV-2. Die Dual-Enzym-Immunoassay-Test (HerpeSelect HSV-1 und HSV-2 enzyme-linked immunosorbent assay) wurde 97% bis 100% Sensitivität und 98% Spezifität für HSV-1 und HSV-2 (41) berichtet. Dieser Test berichtet auch eine schnellere Zeit zu Serokonversion als mit WB verglichen, mit einem mittleren Abstand von 25 Tagen nach dem Auftreten der Symptome zu Serokonversion durch HerpeSelect HSV-1 gegenüber 33 Tage WB und 21 Tage durch HerpeSelect HSV-2 bestimmt zeigen im Vergleich zu 40 Tage von WB in Individuen zuvor nicht positiv für HSV-1 (42).

Antivirale Widerstandstest

Eine Anzahl von antivirale Mittel wurden für die Behandlung von HSV-Infektionen entwickelt; Von diesen ist acyclovir die am häufigsten verwendet. Widerstand von HSV zu acyclovir zunehmend gebräuchlich, werden nahezu alle klinisch signifikanten Acyclovir-resistenten bei immungeschwächten Patienten beobachtet Stämmen, insbesondere jene Koinfektion mit HIV (43, 44). Die Entwicklung von Resistenzen in der Regel ergibt sich aus Mutationen innerhalb des viralen Genoms, und die Anwesenheit von den selektiven Wirkstoffdruck führt in der Regel bei der Entstehung einer resistenten Viruspopulation. Die Isolierung von HSV von Läsionen trotz adäquater Dosierungen und Blutspiegel von Aciclovir persistierenden sollte den Verdacht auf Aciclovir Widerstand erhöhen.

Die antivirale Aktivität von Acyclovir erfordert eine anfängliche Phosphorylierung Schritt durch das virale Enzym Thymidinkinase (TK) (45, 46). Zwei nachfolgende Phosphorylierung Schritte werden durch zelluläre Kinasen vermittelt wird. Das resultierende triphosphorylierte Aciclovir dann hemmt spezifisch Herpes-Virus-DNA-Polymerasen. Drei verschiedene Mechanismen der Resistenz von HSV zu Acyclovir wurden identifiziert. Die häufigste ist in Viren entdeckt, die eine funktionelle TK fehlt (TK — Mutanten) und damit nicht in der Lage zu acyclovir monophosphorylate. Weniger häufig, produzieren einige resistente Viren eine funktionelle TK-Enzym, das wegen der veränderten Substratspezifität Aciclovir phosphoryliert nicht in der Lage ist (TK A-Mutanten). Schließlich kann Widerstand aufgrund von Mutationen sein in veränderter DNA-Polymerase resultierende Bindung und die Verwendung von Aciclovir (DNA pol A).

Foscarnet direkt hemmt Herpes-Virus-DNA-Polymerasen und Resistenz entwickelt wegen veränderter viraler DNA-Polymerasen. TK — — und TK A -resistant HSV Viren Foscarnet empfindlich bleiben, aber diejenigen mit polA Mutationen können Quer resistent sein.

Vidarabine Widerstand kommt auch selten vor. Vidarabin wird durch zelluläre Enzyme phosphoryliert und dann hemmt viral DNA-Polymerase kodiert. TK — und TK A-Mutanten sind immer noch empfindlich auf Vidarabine, während polA Mutanten in der Regel resistent sind.

Drug Empfindlichkeit Assays

Die Komplexität der Arzneimittelempfindlichkeit Assays für die antivirale Resistenz schränkt ihre Verfügbarkeit. In der heutigen Zeit werden sie nur von spezialisierten Laboratorien durchgeführt. Empfindlichkeitsprüfung von Stämmen von HSV gegen verschiedene antivirale Mittel wird gewöhnlich im Labor durchgeführt Modifikationen einer der folgenden verwendet: Plaquereduktionsassays, Farbstoffaufnahme-Assays oder DNA-Hybridisierungsassays (45, 46). Die Plaque-Reduktionstest war die erste antivirale Anfälligkeit Testverfahren durchgeführt, um die Anfälligkeit von Viren auf antivirale Mittel, um zu bestimmen und ist der Standard, an dem andere Tests verglichen werden. Diese Tests sind zeitraubend und können bald durch genotypische Tests ersetzt werden, die schneller verarbeitet werden können. Die viralen Gene, die für die beiden Ziele von antiviralen Medikamenten (TK und DNA-Polymerase) werden durch PCR amplifiziert; die PCR-Produkte werden dann sequenziert.

Kompetenz und Qualitätssicherung

Alle Laboratorien in klinischen Proben diagnostische Dienstleistungen für den Nachweis von HSV Bereitstellung oder HSV serologischen Assays Durchführung von externen Agenturen bei der Prüfung von Eignungs Panels teilnehmen müssen, wenn möglich, für alle Tests durchgeführt. Wenn Eignungsprüfungen für bestimmte Tests nicht zur Verfügung steht (zB HSV DNA-Nachweis in Abstrich Material oder typspezifische serologische Tests), dann Probenaustausch zwischen Laboratorien eine solche Prüfung durchführen, sollten als alternative Form von Eignungsprüfungen angeordnet werden.

Kultur

Subpassages von HSV klinischen Isolate sollten bei jeder Charge von HSV Rollenrohr oder Mantelfläschchen Kulturen dienen als positive Kontrollen beimpft werden. Nicht infizierte Rohre oder Mantelfläschchen Kulturen dienen als Negativkontrollen. Sowohl infizierte und nicht-infizierte Zellmonoschichten sollte auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von HSV CPE und gefärbt zu beobachten für typische Immunofluoreszenz mit HSV monoklonalen Antikörpern beobachtet werden. Die Positivkontrollen sollten charakteristische CPE und Immunofluoreszenz mit typspezifischen Antiseren aufweisen, während negative Kontrollen sollten nicht.

Variationen in der Empfindlichkeit in kultivierten Zelllinien, die aus verschiedenen Gründen auftreten können. Jedoch ist die Routine Verwendung von zwei Zelllinien von akzeptabler Empfindlichkeit nicht erforderlich, da der Unterschied in der Wiedergewinnung von HSV ist weniger als 5% (11).

Direkte Abstriche

Positive und negative Steuerschieber sollten täglich in jedem Durchlauf werden, um sicherzustellen, dass die Antikörper-Reagenzien korrekt durchführen. Typische Immunofluoreszenz sollten in den positiven Kontrollen beobachtet werden, aber nicht die negativen Kontrollen.

Indirekte serologische Methoden

Positive und negative Kontrollen müssen mit jeder Charge von getesteten Seren einbezogen werden. Bei kommerziellen Kits verwendet werden, werden diese Kontrollen in der Regel im Kit enthalten. Ergebnisse in serologischen Tests erhalten sollte und nicht, wenn die Kontrollproben aus dem erwarteten Bereich sind gemeldet werden verworfen. Darüber hinaus sollte die Verwendung von in-house positive und negative Kontrollen angesehen werden. Run-to-Run-Variabilität in Lesungen auf den Kontrollproben sollte verfolgt werden. Erprobung neuer viele Kits sollten vor ihrer Verwendung im Labor durchgeführt werden.

Molecular basierenden Assays

Proficiency-Panels für HSV-Erkennung und Typisierung zur Verfügung stehen (zB College of American Pathologists), aber diese sind weitgehend auf die Validierung von PCR-basierten Assays zur Untersuchung von Virusenzephalitis und Mimik Zerebrospinalflüssigkeit statt Läsion / Tupfer Material ausgerichtet. Die meisten Labors regelmäßige Tests durchführen, um die analytische Sensitivität und Spezifität von irgendwelchen in innerbetrieblichen Verfahren bestimmen. Schwach positive Kontrollen sollten in jedem PCR-Lauf enthalten sein, um konsistente Empfindlichkeit des Tests zusammen mit negativen Extraktion und Verstärkung Kontrollen stellen sicher, um alle mögliche Probleme mit Kontamination bewerten, die zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnten. Interne Kontrollen kann das Vorhandensein von Verstärkungs Inhibitoren nachzuweisen verwendet werden, die zu falsch negativen Ergebnissen führen könnten, obwohl dies selten ein Problem ist.

Anerkennungen

Die Autoren danken Dr. Bonita Lee und Barbara LeBlanc für ihre wertvollen Kommentare und Durchsicht des Manuskripts. Die Autoren möchten diesen Artikel in den Speicher von Dr. Stephen Sacks zu widmen, deren Arbeit dazu beigetragen, bedeutende Fortschritte in der HSV-Infektionen.

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Artikel aus der Canadian Journal of Infectious Diseases &# X0026; Medizinische Mikrobiologie = Journal Canadien des Maladies Infectieuses et de la Microbiologie M&# X00E9; Dicale werden hier zur Verfügung gestellt von Hindawi Publishing Corporation

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